Tak jsem se trochu nudil, tak třba to bude někomu užitečný kromě mě.
· PCR
o udělá se normální PCR
o pokud máme PCR už hotovou neměla by být zmražená, spíš v lednici max. tak dvě tři noci
· ELFO - 2 možnosti:
1. Pustí se na normální ELFO na 1% gel (5 µl PCR produktu +1 µl loadovacího pufru ) a zjistíme, jestli je tam fragment co chceme
2. Udělám 1,5% gel (0,9 g agarosy a 60 ml TBE na malou vaničku) a pustím všechen PCR produkt na gel (50 µl PCR produktu + 8 – 10 µl loadovacího pufru), nesmíme zapomenout, že je potřeba větší hřeben a mezi vzorky vynechat místo
o Pokud provedeme krok 1, tak pak provedeme stejně uděláme krok 2
o Do ELFO vany dáme nový TBE pufr (když není umíchá se 200 ml 5xTBE pufru s 1800 ml destilky, vyjde nám tím 0,5 TBE)
· Vyřezání z gelu
o Je nutno mít něco s dlouhým rukávem, aby nás UV světlo nepopálilo (pokud netoužíte po horském sluníčku). Od věci není ani vzít si štít na oči
o Před vyřezáváním si skalpem dezinfikujeme ohněm (namočit v lihu a zapálit, pokusit se nezapálit stůl nebo podlahu.)
o Vyřeženem, co nejpřesněji
· Izolace DNA z gelu dle použitého kitu
· Změříme koncentraci DNA na nanodropu
· Ligační směs
o Ligační směs umícháme dle návodu níže (dvě možnosti)
o T4 ligázu je nezbytné držet na ledu
1. Pokud je koncentrace DNA malá:
|
Ligační pufr |
5 µl |
|
pGEM plasmidy |
1 µl |
|
PCR produkt |
3 µl |
|
T4 ligáza |
1 µl |
2. Pokud je koncentrace DNA dostatečná
|
Ligační pufr |
5 µl |
|
pGEM plasmidy |
1 µl |
|
PCR produkt |
1 µl |
|
T4 ligáza |
1 µl |
|
Voda |
2 µl |
o Necháme působit
§ 1 hodinu při pokojové teplotě (a jdem v klidu na oběd)
§ 24 hodin při 4°C přes nic (aneb dáme do lednice a jdem na pivo)
· Výtěžek by měl být při této variantě vyšší
· Přídání ligační směsi k buňkám (jenž otrocky zneužijeme)
o Provedeme do 1,5 ml zkumavky
o Dáme si špičky (200 µl a 20 µl nebo 10 µl do mrazáku)
o Zapneme si termoblok na 42 °C
o Vyndáme si kompetenční buňky na led a necháme rozmrznout
§ Buňky jsou náchylné na teplo, z ledu vyndávat jen na co nejkratší chvilku
o Přidíme ligační (10 µl) směs k buňkám (bez bublin!!!)
o Necháme 20 minut na ledu
o Přeneseme na 45 sec. Na termoblok a buňky šokujeme
o Vrátíme buňky na 2 minuty na led
· Už nemusíme pracovat na ledu
· Doplníme do cca 1 ml LB médiem
· Necháme 90 minut třepat, 37°C na 220 RPM (při velké chuti na pivo stačí i 60 minut)
· Během 90 minut si dojdeme na oběd a připravíme si plotny
o Směs na jednu plotnu
|
IPTG (0,1 mol) |
100 µl |
|
Ampicilin |
25 µl |
|
XGAL |
20 µl |
· Stočíme
o 10 minut na 5000 g
· Odsajeme většinu supernatantu a zbytek resuspendujeme
· Naneseme 100 – 200 µl na plotny a dáme do termáku, nejdřív víčkem nahoru a cca po 15 minutách otočíme a necháme buňky narůst přes noc
· Vypícháme bílé kolonie do 10 µl destilky a dáme do cycléru a pustíme program LIKV (doplnit program LIKV)
· Umícháme si master mix
o Doplníme časem
· Pustíme jakýkoliv program, klidně i na LA, ale třetí teplota bude 72°C
· Uděláme klasickou ELFO
· Vypícháme zbytek kolonií, které vyšly na ELFO do 4 ml LB média + 4 µl Ampicilinu a necháme narůst přes noc na třepačce
· Izolace plasmidu záleží na na použitím KITu
o Do 1,5 ml zkumavky si dám narostlé bakterie a stočím, pak odsaju supernatant a opakuju ještě jednou, abychom získali víc plasmidů, pak resuspenduju
o Dále dle návodu v KITu
· Sekvenace
o Mělo by tam být alespoň 400 µg DNA na reakci
o Namícháme sekvenační směs a dáme sekvenovat
Založeno na Protokolu Tomáše Pánka